Test IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR

Walidacja analityczna i badania swoistości krzyżowej

W oparciu o niezwykłą zgodność z opublikowanymi sekwencjami genetycznymi wirusa z ogniska epidemii wśród ludzi, Laboratoria Referencyjne IDEXX opracowały nowatorski test real time PCR w do wykrywania SARS-CoV-2 (COVID-19). Test IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR spełnił wszystkie wymagania analityczne związane z procedurą walidacji. Badania swoistości nie wykazały reakcji krzyżowej z nowym testem PCR w kierunku innych koronawirusów zwierzęcych występujących często u zwierząt towarzyszących. Wykazano również, że dostępne obecnie testy RealPCR do badania występowania w/w koronawirusów zwierzęcych nie wykrywają syntetycznego kwasu nukleinowego COVID-19. Testy diagnostyczne IDEXX RealPCR zostały zaprojektowane i wykonane na standardowej platformie real time PCR w West Sacramento, w Kalifornii, w laboratorium diagnostyki molekularnej (PCR). Przy użyciu nowego testu IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR przeprowadzono ponad 3500 badań przesiewowych próbek pobranych od psów, kotów i koni. Próbki pacjentów były dostarczane z terenu USA i Korei Południowej przez okres czterech tygodni począwszy od 14 lutego 2020 r. i pochodziły z takich rejonów, jak okolice Seattle, w których obecnie stwierdza się przypadki COVID-19 u ludzi. Próbki były równolegle badane także trzema testami opracowanymi przez Ośrodki Zwalczania Chorób i Prewencji (Centers for Disease Control and Prevention, CDC). Jak dotąd żadna z przebadanych próbek nie dała wyników dodatnich. Monitorowanie psich i kocich próbek dostarczonych do celów diagnostyki patogenów układu oddechowego za pomocą paneli PCR trwa i zostanie rozszerzone na dodatkowe rejony na całym świecie.

Zasada testu i jego walidacja analityczna

Test IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR jest ukierunkowany na ten sam gen nukleokapsydu co testy CDC. Ten obiekt docelowy wybrano na podstawie analizy sekwencji, która wykazała jego wysoce konserwatywny charakter oraz spełnianie kryteriów dotyczących temperatury topnienia i wymagań analitycznych naszej standaryzowanej platformy. Walidacja testu polegała najpierw na analizie sekwencji z wykorzystaniem algorytmu blast w porównaniu do ponad 300 ogólnie dostępnych sekwencji genetycznych. Po drugie zastosowano syntetyczną kontrolę dodatnią do funkcjonalnej walidacji testu, który spełnił wymagania dotyczące stosunku sygnału do zakłóceń w czasie amplifikacji, skuteczności, powtarzalności w ramach testów i między testami oraz korelacji. Ponadto spółka IDEXX wprowadziła trzy testy CDC, do przeprowadzania równolegle z testem IDEXX w celu potwierdzania wyników. Te trzy testy potwierdzające są zaadaptowanymi testami CDC, po raz pierwszy opublikowanymi 24 stycznia 2020 r.1,2

Swoistość krzyżowa wszystkich czterech testów (SARS-COV-2) została potwierdzona przy użyciu syntetycznej kontroli dodatniej koronawirusów zwierzęcych i dostarczonych w ramach oferty diagnostycznej IDEXX próbek, dających dodatnie wyniki w testach PCR wykrywających koronawirusa układu oddechowego psów, koronawirusa jelitowego psów i kotów oraz koronawirusa jelitowego koni. W czasie fazy walidacji testu PCR w czasie rzeczywistym i badania przesiewowego przeprowadzono następujące kontrole: 

  • Ujemną kontrolę ekstrakcji (NEC): wszystkie ujemne kontrole ekstrakcji w testach PCR dały wynik ujemny.
  • Poprzedzającą analizę kontrolę jakości próbek, przeprowadzoną za pomocą testu PCR w czasie rzeczywistym TaqMan® w odniesieniu do endogennego genu kontrolnego. Wszystkie próbki, zarówno ujemne, jak i dodatnie, spełniły kryteria kontroli jakości.
  • Kontrole ujemne PCR: wszystkie ujemne kontrole PCR dały ujemne wyniki.
  • Kontrole dodatnie PCR: wszystkie przetestowane dodatnie kontrole PCR (syntetyczna kontrola dodatnia) dały wyniki dodatnie.
  • Monitoring skażenia środowiska: wszystkie próbki z różnych lokalizacji w laboratorium PCR dały ujemny wynik monitoringu skażenia

Próbki z wynikiem dodatnim testu PCR w kierunku występowania koronawirusa układu oddechowego psów, koronawirusa jelitowego psów i kotów oraz koronawirusa jelitowego koni, które zostały dostarczone w ramach oferty diagnostycznej IDEXX, zostały poddane także badaniu za pomocą wszystkich testów wykrywających SARS-CoV-2. Wszystkie oznaczenia CDC i IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR dały w odniesieniu do populacji innych koronawirusów wyniki ujemne.

Metodyka badań przesiewowych

Użyto próbek wybranych losowo spośród próbek dostarczonych w ramach oferty diagnostycznej RealPCR IDEXX dotyczącej wirusów powodujących choroby układu oddechowego psów, układu oddechowego kotów, układu oddechowego koni oraz biegunkę kocią, biegunkę psią i biegunkę koni. Do pierwszych próbek wykorzystanych w badaniu przesiewowym należały wymazy (większość wymazów z głębszych rejonów gardła i spojówek [oko]) i próbki kału. Spośród ponad 3500 próbek poddanych badaniu przesiewowemu między 14 lutego a 12 marca:

  • próbki pochodziły ze wszystkich 50 stanów USA i z Korei Południowej.
  • 55% próbek pochodziło od psów, 41% od kotów a 4% od koni.
  • 77% pobrano z układu oddechowego, 23% z kału.

 

Bibliografia

  1. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use. CDC publication CDC-006-00019, wersja: 02. www.fda.gov/media/134922/download. Obowiązuje od 15 marca 2020. Dostęp: poniedziałek, 16 marca 2020 r.
  2.  Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. Tylko do celów badawczych Protokół Real-Time RT-PCR do wykrywania 2019-nCoV. www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html. Aktualizacja: 14 marca 2020. Dostęp: poniedziałek, 16 marca 2020 r.